Γεννήθηκε στις 13 Μαΐου 1883, ο πατέρας του ήταν επίσης γιατρός. Μεγάλωσε σε ένα σπίτι με ενδιαφέρον για τις τέχνες και τις επιστήμες.
Μεγαλώνοντας άρχισε να μαθαίνει Γαλλικά, στην ηλικία των 15 πέρασε στην ιατρική σχολή Αθηνών και κατά την διάρκεια των σπουδών του ο πατέρας του επέμενε να γίνει στρατιωτικός γιατρός . Ήταν ελεύθερο πνεύμα γεμάτος με όρεξη για την ζωή, ήθελε να ταξιδέψει και να συνεχίσει τις σπουδές του στο εξωτερικό. Το 1907 με την βοήθεια των γονιών του φεύγει για την Γερμανία, εκεί ασχολείται με την βιολογία και ανακαλύπτει μια νέα αγάπη, τις εργαστηριακές μελέτες.
Τα επόμενα χρόνια της ζωής του επιστρέφει στην Ελλάδα , γνωρίζει και παντρεύεται την γυναίκα του. Το 1913 το ζευγάρι φεύγει για την Αμερική, ο Παπανικολάου ήταν πλέον ένας λαμπρός επιστήμονας.
Αποφασισμένος να εξελίξει τις γνώσεις του αρχίζει να μελετάει τα κολπικά επιχρίσματα των ινδικών χοιριδίων. Παρατηρώντας τα ικανοποιητικά αποτελέσματα αρχίζει να μελετάει τη διαγνωστική αξία της κυτταρολογικής εξέτασης του κολπικού επιχρίσματος στις γυναίκες.
Η πρώτη του ανακοίνωση σχετικά με τη χρήση της κυτταρολογικής μεθόδου προς διάγνωση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, το 1928, έγινε δεκτή με πολύ σκεπτικισμό, καθώς η κρατούσα τότε γνώμη, για τέτοιου είδους έρευνα και εφαρμογή, επί αποφολιδουμένων κυττάρων ήταν πρακτικά αδύνατη.
Τέτοια διάγνωση θεωρούνταν δυνατή, μέχρι την εποχή εκείνη, μόνο με την τομή του πάσχοντος οργάνου.
Ο Παπανικολάου συνέχισε να μελετάει και να δημοσιεύει εργασίες. Μέσα από την σκληρή δουλειά του έγινε ο θεμελιωτής ενός νέου επιστημονικού κλάδου, της «αποφολιδωτικής κυτταρολογίας». Από το 1940 και μετά, περίπου 20 χρόνια μετά την πρώτη του εργαστηριακή μελέτη, ξεκινούν οι μαζικοί έλεγχοι των γυναικών στην Αμερική.
Εκπαίδευσε πολλούς γιατρούς, ήταν ένας άνθρωπος ταπεινός και πρόθυμος να μεταφέρει τις γνώσεις του. Η επιτροπή των βραβείων Νόμπελ αρνήθηκε όχι μια αλλά δύο φορές να του δώσει βραβείο. Υποστήριξαν ότι δεν μπορούσαν να βραβεύσουν μία μέθοδο για θεραπεία, αλλά την ανακάλυψή της.
